Прайм-редактирование

Прайм-редактирование отвечает на ограничение, которое обе предыдущие химии оставляют открытым. Нуклеазное редактирование способно вписать произвольную последовательность, но требует двухцепочечного разрыва, донорной матрицы и, значит, делящейся клетки; базовое редактирование не требует ни того ни другого, но делает только транзиции внутри узкого окна. Прайм-редактирование записывает произвольную короткую последовательность — все замены оснований, а также малые вставки и делеции — без двухцепочечного разрыва и без отдельного донора.

Ответ приносит с собой направляющая

Механизм держится на одном конструкторском ходе: новая последовательность путешествует вместе с направляющей. Молекула pegRNA — это обычная направляющая, удлинённая с 3’-конца двумя отрезками. Первый, участок посадки праймера, комплементарен той геномной цепи, которую редактор только что надрезал. Второй — матрица обратной транскрипции, кодирующая то, как правка должна читаться.

Белок представляет собой никазу Cas9, слитую с инженерной обратной транскриптазой. Она надрезает цепь, освобождая 3’-конец; участок посадки праймера отжигается на этом конце; обратная транскриптаза достраивает его, переписывая матрицу в ДНК. В этой точке у клетки теперь есть новосинтезированный 3’-лоскут с правкой и исходный 5’-лоскут со старой последовательностью. Разрешение лоскутов — это равновесие, и правка закрепляется, только если побеждает новый лоскут и цепь сшивается. Надрез противоположной, неотредактированной цепи (схема PE3) склоняет репарацию к переносу правки и в неё — ценой второго надреза и тех инделей, которые дают два близких надреза.

Почему вся работа — в конструировании

У прайм-редактирования нет отдельной доставки донора, которую можно было бы оптимизировать, поэтому практически вся его эффективность заключена в pegRNA. Длина участка посадки праймера — это размен между устойчивостью затравки и конкуренцией с целой геномной цепью; матрица обратной транскрипции должна быть достаточно длинной, чтобы вместить правку и гомологию за ней, но длинный одноцепочечный хвост деградирует и сворачивается. Структурированные мотивы, добавленные на 3’-конец pegRNA против экзонуклеазного обкусывания, сами по себе дали заметный прирост эффективности. У каждой позиции-мишени свой оптимум — поэтому прайм-редактирование подбирают экспериментально, а не предсказывают.

Скрытый противник — репарация неспаренных оснований

Свежевписанная правка стоит в дуплексе как неспаренная пара, а система репарации таких пар — активнейший надзорный механизм, чья работа состоит ровно в её удалении. Она предпочтительно вырезает надрезанную, только что синтезированную цепь — то есть отредактированную, — возвращая исходный вариант. Временное подавление этого пути во время редактирования, схемы PE4 и PE5, подняло эффективность в несколько раз и заодно снизило долю побочных инделей. Сильнее всего эффект для однонуклеотидных правок, более всего похожих на обычные ошибки репликации; длинные вставки распознаются и чинятся хуже.

Размен формулируется честно: прайм-редактирование избегает разрыва и его структурных последствий, а платит более длинной и труднее доставляемой конструкцией и эффективностью, зависящей от мишени. Нуклеазная и дезаминазная химии описаны на своих страницах; доставка здесь не рассматривается.