Редактирование генома

Все программируемые редакторы первого поколения — нуклеазы с цинковыми пальцами, TALEN, CRISPR-Cas9 — делают с ДНК одно и то же: вносят двухцепочечный разрыв в выбранной точке. Различаются они лишь способом выбора этой точки. Цинковые пальцы и модули TALE читают последовательность белковыми блоками; Cas9 читает её направляющей РНК, спаривающейся с одной из цепей, при условии, что рядом есть короткий мотив PAM. Программируемость настоящая, и именно она дала полю скорость. Она же — весь вклад нуклеазы. Саму правку пишет клетка.

Результат принадлежит пути репарации

Разорванная хромосома — смертельное повреждение, поэтому клетка чинит её немедленно тем путём, который доступен. Негомологичное соединение концов сшивает два конца обратно и работает во всех фазах цикла; оно неточно, и повторные циклы разрезания и сшивания рано или поздно оставляют в месте стыка небольшие вставки или делеции. В кодирующем экзоне такие индели сдвигают рамку считывания — поэтому этот путь остаётся надёжной дорогой к выключению гена, и поэтому первыми терапевтическими успехами стали разрушения, а не исправления.

Записать заданную новую последовательность можно только через гомологичную репарацию, а ей нужны донорная матрица с плечами гомологии и сестринская хроматида — то есть фазы S и G2. Одно это ограничение объясняет большую часть клинических трудностей. Нейроны, кардиомиоциты и основная масса покоящихся гепатоцитов не делятся, поэтому путь, способный вписать правильное основание, практически недоступен ровно в тех тканях, где наследственная болезнь и наносит ущерб. Химии редактирования, вовсе обходящиеся без разрыва, возникли именно из-за этого ограничения; им посвящены соседние страницы о базовом и прайм-редактировании.

Нецелевая активность — измеримая величина

Направляющие РНК терпимы к несовпадениям, особенно вдали от PAM, и допускают небольшие петли, поэтому у каждой направляющей есть набор почти-родственных сайтов в геноме. Это измеряют, а не предполагают. Метод GUIDE-seq захватывает короткий двухцепочечный олигонуклеотид в местах разрывов в живых клетках; CIRCLE-seq и родственные пробирочные методы режут очищенную геномную ДНК и с высокой чувствительностью выдвигают кандидатов. Оба лишь выдвигают; подтверждает прицельное глубокое секвенирование. Высокоточные инженерные варианты нуклеазы и доставка в виде рибонуклеопротеина, сокращающая время присутствия фермента, снижают нагрузку.

Недооценённый риск лежит в целевой точке

Более тяжёлые повреждения нередко возникают ровно там, где разрез и планировался. Среди опубликованных последствий одиночного разрыва — делеции масштаба тысяч пар оснований, потеря гетерозиготности в окружающей области, утрата целого плеча хромосомы и хромотрипсис, то есть дробление разрезанной хромосомы и её ошибочная пересборка. Два разреза в одной клетке добавляют транслокации. Ничего из этого не видит короткий ампликонный анализ вокруг места разреза: он сообщает только о том, что его праймеры всё ещё амплифицируют, и утраченный аллель выглядит как нередактированный. Нужны методы кариотипического масштаба и длинные чтения, а отсутствие таких данных в отчёте о редактировании не есть доказательство отсутствия самих событий.

Эта страница описывает общее для всех редакторов. Доставка, биоизоляция и конкретные химии разобраны на отдельных страницах.