Эпигеномное редактирование

Эпигеномное редактирование оставляет последовательность ДНК нетронутой и меняет её регуляторное состояние. Конструкция знакомая, но с отключённой функцией разрезания: каталитически мёртвый Cas9 сохраняет связывание по направляющей, ничего не режет и служит исключительно программируемым якорем. К нему пришит эффекторный домен, который пишет или стирает химическую метку на ДНК либо на упаковывающих её гистонах.

Что делают эффекторы

Лучше всего охарактеризована метка ДНК — 5-метилцитозин в динуклеотидах CpG. Домен ДНК-метилтрансферазы, обычно каталитическая область DNMT3A в паре с партнёрским DNMT3L, наносит её по целевому промотору; домен диоксигеназы семейства TET ведёт обратную реакцию, окисляя метильную группу и запуская её удаление. Гистоновые эффекторы меняют вместо этого состояние хроматина: домен KRAB привлекает корепрессорный комплекс, откладывающий репрессивное триметилирование H3K9, а ацетилтрансферазные домены вроде p300 добавляют ацетилирование, характерное для активных энхансеров. Доступна и простая стерическая блокировка — самая слабая форма: севший на промотор dCas9 мешает транскрипционной машине и больше не делает ничего.

Преимущество перед правкой последовательности конкретно и заслуживает прямой формулировки. Нет разрыва, нет пути репарации и нет необратимого изменения, поэтому непреднамеренное связывание не оставляет рубца в геноме. Метод работает и на регуляторных элементах — энхансерах, промоторах, — где нужна дозировка, а не смена кодирующей записи, и способен через один общий мотив действовать сразу на несколько генов семейства.

Честный вопрос — наследуемость

Именно здесь литературу надо читать внимательно. Присутствующий эффектор ещё не доказывает долговечности результата: написанная метка должна пережить деления клеток после того, как эффектор убран, иначе ген просто вернётся в прежнее состояние. Это различие разделяет два совершенно разных продукта: временную модуляцию на дни и однократное введение, устанавливающее устойчивое молчание гена.

Механистически долговечность держится на самоподдерживающейся химии. Поддерживающая метилтрансфераза копирует метилирование CpG на дочернюю цепь при репликации, а репрессивные гистоновые метки привлекают ферменты, пишущие такие же, — поэтому достаточно установившееся состояние умеет воспроизводить себя. В опытах сочетание метилирования ДНК с гистоновой репрессией давало молчание, сохранявшееся через многие деления после ухода редактора, тогда как одиночный эффектор часто расслабляется. Результат сильно зависит от локуса: плотность CpG-островка, контекст хроматина и тип клеток меняют ответ, и долговечность на одном промоторе ничего не говорит о другом.

Отсюда два ограничения, о которых стоит помнить при чтении заявленных результатов. Часть мишеней вообще не поддаётся устойчивому выключению. И ровно долговечность оказывается тем, что захочется отменить, если эффект окажется вредным, — поэтому продемонстрированное обращение прицельной деметилазой входит в честную аргументацию, а не является дополнительной опцией. Практический вывод для проверки любого такого результата один: смотреть не на глубину подавления в момент действия эффектора, а на то, что измерено через десятки делений после его исчезновения, и в тех же клетках.

Нецелевое связывание, подбор направляющих и доставка следуют общему разбору на странице «Редактирование генома»; специфично здесь то, что ошибочный исход — это неверно регулируемый ген, а не мутация.