CRISPR-скрининг как сервис

Пулированный CRISPR-скрининг выясняет, какие гены важны для выбранного признака: каждый ген выключают в своей клетке внутри одной смешанной популяции, а затем позволяют признаку изменить состав этой популяции. Считывание здесь не микроскопия и не сигнал теста, а подсчёт. Последовательности направляющих амплифицируют из геномной ДНК до и после отбора и секвенируют, и важность гена проявляется как изменение представленности его направляющих. Всё трудное в скрининге вытекает из того, что это эксперимент на подсчёт.

Одна направляющая на клетку и достаточно клеток на направляющую

Две величины определяют, способен ли опыт вообще что-то ответить.

Библиотеку доставляют лентивирусом, а заражение вирусом — случайный процесс. При высокой множественности заражения многие клетки получают по нескольку направляющих, и приписать возникший признак какой-то одной из них невозможно. Поэтому заражают при низкой множественности, целясь в режим, где большинство трансдуцированных клеток несёт одну встройку, а незаражённое большинство убирают отбором. Согласие выбросить большую часть культуры — это цена интерпретируемости.

Вторая величина — покрытие: сколько клеток несёт каждую направляющую. Поскольку считывается изменение относительной представленности на фоне шума выборки, направляющая, представленная слишком малым числом клеток, даёт счёт, колеблющийся по причинам, не имеющим отношения к биологии. Скрининг планируют в клетках на направляющую, и это число надо удерживать на каждом шаге — при заражении, отборе, каждом пассаже и финальном сборе, — потому что статистику задаёт самое узкое место, а не исходная культура. Несколько независимых направляющих на ген плюс ненацеленные контроли и контроли в безопасных локусах — это то, что позволяет отделить вывод об уровне гена от особенностей одной направляющей.

Выпадение и обогащение — разные эксперименты

Скрининг на жизнеспособность просто даёт популяции расти. Направляющие против генов, нужных для деления, становятся реже; сигнал здесь отрицательный отбор, и он выявляет существенные гены, а в присутствии лекарства — гены, утрата которых даёт чувствительность к нему. Ограничения встроены в саму схему: видны только признаки, меняющие скорость роста, нужно достаточно удвоений популяции, чтобы обеднение накопилось, а медленно растущую находку трудно отличить от шума.

Скрининг с положительным отбором — выживание под летальным лекарством или токсином — статистически много легче, поскольку выжившие обогащаются от почти нулевого фона, а не обедняются от большого.

Сортировка по репортёру измеряет то, чего тест на выживание не достаёт: экспрессию конкретного гена, показатель работы пути, поверхностный маркёр. Клетки сортируют по флуоресценции на фракции и секвенируют каждую, так что признак становится молекулярным, а не приспособительным. Плата за это — собственный предел производительности сортировки, который покрытие обязано пережить.

Что является результатом

Скрининг возвращает ранжированный список кандидатов, и этот список есть гипотеза. Проверка отдельными направляющими, а лучше и независимым по природе воздействием, входит в состав эксперимента, а не следует за ним. Поведение самой нуклеазы — исходы репарации, нецелевые разрезы — разобрано на странице «Редактирование генома»; сюда оно входит лишь как источник ложных находок, ведь само разрезание токсично пропорционально числу копий, и амплифицированные участки выпадают по причинам, к гену отношения не имеющим.