Базовое редактирование

Базовое редактирование убирает тот самый шаг, который страница «Редактирование генома» называет источником большинства бед: обе цепи не разрезаются, поэтому исход не передаётся на откуп пути репарации. Вместо этого химическое превращение выполняется прямо на основании, на месте, ферментом, не имеющим отношения к нуклеазам.

Почему R-петля делает химию возможной

Используемые дезаминазы специфичны к одноцепочечной ДНК: они работают на неспаренных участках и не достают до основания внутри целой двойной спирали. Cas9 поставляет ровно такой субстрат как побочный результат своего связывания. Когда направляющая РНК спаривается с целевой цепью, вторая цепь вытесняется в виде неспаренной одноцепочечной ДНК — эта структура и называется R-петлёй. Дезаминаза, пришитая к каталитически ослабленному Cas9, тем самым удерживается у короткого отрезка открытой, химически доступной ДНК в программируемой точке.

Цитозиновая дезаминаза превращает цитозин в урацил, который полимераза читает как тимин, что даёт замену C·G на T·A. Цитозиновые редакторы несут ещё и ингибитор урацил-гликозилазы: иначе эксцизионная репарация оснований удалит урацил и отменит правку до репликации. Адениновые редакторы используют выведенную в лаборатории дезоксиаденозиндезаминазу — природного фермента, работающего с аденином ДНК, попросту не было, — и дают инозин, читаемый как гуанин, то есть замену A·T на G·C. Надрез неотредактированной цепи склоняет репарацию к тому, чтобы взять за образец отредактированную, и именно это поднимает эффективность до публикуемых значений.

Окно — одновременно спецификация и дефект

Длина сшивки и геометрия Cas9 помещают доступный одноцепочечный участок в окно около пяти нуклеотидов внутри протоспейсера. Любое целевое основание внутри этого окна является субстратом. Если рядом с патогенным цитозином через две позиции стоит другой цитозин, правятся оба — это редактирование-«попутчик», и направляющая их не разделит. Ответом служат варианты с суженным окном и белки Cas с иным распознаваемым мотивом PAM, сдвигающие окно; задача конструирования часто сводится к поиску направляющей, у которой в окне окажется одно основание и ни одного лишнего.

Ограничения, которые стоит называть прямо

Напрямую доступны только транзиции: C в T и A в G вместе с комплементарными им. Трансверсии химией дезаминирования не достигаются и требуют других подходов — гликозилазных редакторов в частных случаях и прайм-редактирования в общем.

Два класса нецелевых событий отличаются от нуклеазных. Дезаминирование без участия направляющей происходит везде, где возникает временная одноцепочечная ДНК — у вилок репликации, в пузырях транскрипции, — потому что дезаминаза каталитически активна независимо от того, нашёл ли Cas9 свой сайт; анализы, разглядывающие только похожие на направляющую сайты, его не видят. Цитозиновые дезаминазы ранних редакторов работали и на РНК, давая множественные правки по всему транскриптому; инженерные варианты со сниженной активностью к РНК решают эту задачу, и сообщать такие данные теперь принято.

Доставка, иммуногенность и структурные повреждения от двухцепочечных разрывов разобраны в других местах; собственный профиль риска базового редактирования — химический.