Структурная биология и криоэлектронная микроскопия

Одночастичная криоэлектронная микроскопия определяет трёхмерную структуру без кристалла. Тонкую водную плёнку с очищенной молекулой замораживают, снимают в просвечивающем электронном микроскопе, а сотням тысяч изображений отдельных частиц — каждое шумная проекция с неизвестного направления — вычислительно приписывают ориентации и объединяют их в карту плотности, в которую затем встраивают атомную модель.

Витрификация, а не замораживание#

Образец нужно заморозить так быстро, чтобы вода затвердела, не кристаллизуясь. Кристаллический лёд рассеивает электронный пучок и разрушает изображение, а его образование ещё и вытесняет растворённые вещества, концентрируя соли и повреждая препарат. Погружение субмикрометровой плёнки в жидкий этан даёт скорости охлаждения, достаточные, чтобы запереть воду в аморфном, стеклоподобном состоянии. Дальше съёмка идёт при криогенной температуре и строго ограниченной дозе электронов, потому что пучок повреждает образец: сколько сигнала можно снять с одной частицы, определяет радиационное повреждение, а не качество детектора, — поэтому и нужны тысячи изображений, чтобы усреднением подавить шум.

Главная практическая беда — граница вода-воздух#

В секунды перед заморозкой плёнка имеет толщину лишь в десятки нанометров, и молекулы многократно пересекают её при диффузии. Большинство успевает много раз побывать на границе вода-воздух, а эта граница денатурирует: она способна развернуть белок, разобрать комплекс, а уцелевшим навязать преимущественную ориентацию, поскольку частица адсорбируется в определённом положении. Отсюда происходит большинство неудачных сеток и характерные для поля средства борьбы: поверхностно-активные вещества, поддерживающие плёнки из графена или аморфного углерода, аффинные подложки, удерживающие частицу вдали от границы, и более быстрые устройства заморозки, сокращающие время экспозиции.

Преимущественная ориентация важна потому, что реконструкции нужны виды, распределённые по всем направлениям. Если частицы принимают лишь узкий набор положений, карта анизотропна: резкая в одних направлениях и размытая в других, причём усреднённая цифра разрешения этот дефект скрывает. Стандартное средство — наклон столика при съёмке, ценой большей эффективной толщины льда и худших изображений.

Гетерогенность, а не микроскоп#

Современные приборы и прямые электронные детекторы для большинства задач давно перестали быть ограничением. Разрешение ограничивает то, что усреднение предполагает одинаковость частиц, а биологические молекулы движутся. Подвижные домены, частично занятые лиганды, изменчивость состава и непрерывное конформационное движение — всё это размывает среднее. Классификация разделяет дискретные состояния и позволяет получить для каждого более высокое разрешение ценой меньшего числа частиц в классе, а методы моделирования непрерывного движения активно развиваются, — но подвижная область останется плохо разрешённой независимо от числа снимков.

Как читать цифру разрешения#

Публикуемое разрешение — обычно глобальная оценка по корреляции фурье-оболочек между двумя независимо восстановленными половинными картами, по соглашению при пороге 0,143. Это среднее по всей карте. Структура с высоким глобальным разрешением сплошь и рядом содержит упорядоченное ядро около этого значения и периферию в несколько раз хуже, — поэтому оценки локального разрешения и депонированные половинные карты важнее заголовочной цифры. Правильный вопрос к опубликованной структуре — не её число, а поддерживает ли плотность именно тот признак, о котором идёт речь.