Масс-спектрометрическая протеомика

Для белков не существует полимеразы. Любой метод обнаружения нуклеиновой кислоты может сначала наработать её копии, и одна молекула превращается в измеримое количество. У протеомики такого шага нет: что есть в образце, то и есть, и прибор обязан обнаружить это напрямую. Поэтому чувствительность здесь — жёсткий физический предел, а не вопрос числа циклов.

Динамический диапазон плазмы#

Плазма человека — крайний случай. Концентрации белков охватывают примерно десять порядков: от альбумина в десятках миллиграммов на миллилитр до белков тканевой утечки и цитокинов в пикограммах. На один альбумин приходится около половины всей белковой массы, а на несколько самых обильных видов — подавляющее большинство. Масс-спектрометр, работающий с такой смесью, тратит время съёмки на обильные белки, а малопредставленные, к которым и относится основной клинический интерес, просто никогда не отбираются. Удаление обильных белков и фракционирование помогают оба и оба вносят свою беду: антитела для удаления уносят вместе с мишенью её связанных партнёров, а фракционирование умножает приборное время на образец.

Зависимый от данных отбор выбирает стохастически#

В классическом рабочем цикле прибор обозревает ионы, выходящие в данный момент, берёт наиболее интенсивные и фрагментирует их для опознания. Когда одновременно выходит больше пептидов, чем успевает обработать рабочий цикл, отбор превращается в гонку, и пептид у порога может быть выбран в одном запуске и пропущен в следующем. Отсюда знакомая по любому крупному исследованию картина пропусков: матрицы со значительными прорехами, которые не случайны, а зависят от содержания, — и это смещает как заполнение пропусков, так и проверку различий.

Независимый от данных отбор бьёт ровно сюда. Вместо выбора предшественников прибор фрагментирует всё, что попадает в серию широких окон по массе, обходя диапазон по жёсткому расписанию. Каждый пептид образца фрагментируется в каждом запуске, поэтому съёмка воспроизводима, а доля пропусков резко падает. Цена переносится на данные: получаемые спектры — химерные смеси фрагментов множества предшественников, и выделение отдельных пептидов требует либо спектральной библиотеки, либо разложения без неё.

Задача вывода белка#

Протеомика «снизу вверх» расщепляет белки до пептидов и измеряет пептиды; результат на уровне белка восстанавливается потом, и восстановление это небезупречно. Многие пептиды общи для членов семейства белков или для изоформ сплайсинга и не могут быть отнесены однозначно. О белке нередко сообщают по свидетельству нескольких пептидов, которые могут лежать в доступных участках и ничего не говорить об остальной молекуле. Посттрансляционные модификации меняют массу пептида и выводят его из поиска, если их явно не учли, — поэтому немодифицированный пептид способен занизить содержание белка, чей пул сильно модифицирован. Само протеолитическое расщепление неполно и зависит от последовательности.

Отсюда следует, что «количество белка» в опыте «снизу вверх» — это модельная сводка по тем пептидам, которые довелось увидеть. Там, где различие существенно — изоформ-специфичная биология, стехиометрия модификаций, продукты деградации, — эталоном остаются целевые методы, измеряющие названные пептиды против изотопно меченных стандартов, а аффинные платформы не снимают вопрос специфичности, а заменяют его специфичностью реагента.