Геномика и ДНК-дизайн

Писать ДНК стало настолько обыденно, что ограничивающим шагом обычно оказывается проектирование, а не сборка. Но пространство проектирования ограничено дважды: тем, что физически способны выдать химия и сборка, и тем, что клетка-хозяин сделает с последовательностью, когда получит её.

Ограничения синтеза решают, что можно заказать#

Поставщики отклоняют последовательности или берут за них надбавку по причинам сугубо физическим. Худший нарушитель — длинные повторы: одинаковые участки вызывают неправильный отжиг праймеров при амплификации и неверную стыковку при сборке по гомологии, поэтому конструкция с тандемными повторами или множеством копий одного промотора может оказаться несобираемой, хотя каждое основание в ней законно. Второе ограничение — крайние значения GC-состава: богатые GC участки образуют устойчивую вторичную структуру, тормозящую полимеразу и присоединение, а богатые AT дестабилизируются и могут теряться. Шпильки и G-квадруплексы мешают и синтезу, и проверке секвенированием. Поэтому практическое проектирование намеренно разрывает повторы, делая функционально одинаковые элементы различными по последовательности за счёт синонимичной перекодировки, и выравнивает GC-состав по конструкции. Первая задача проектного инструмента — оценка собираемости, а не оптимизация.

Оптимизация кодонов реальна и регулярно преувеличивается#

Частота использования кодонов различается между организмами и связана с содержанием соответствующих транспортных РНК, поэтому перекодировка гена под предпочтения хозяина способна заметно поднять выход белка — для гетерологичной экспрессии это установлено надёжно. Преувеличение начинается там, где эффект считают всеобщим и монотонным. Часто лимитирующей стадией оказывается инициация трансляции, а там главная переменная — не выбор кодонов, а энергия сворачивания матричной РНК вокруг стартового кодона: сильная локальная структура закрывает посадку рибосомы, и замена нескольких оснований у 5’-конца может перевесить перекодировку всего гена. У редких кодонов есть и функции: замедление элонгации на границах доменов, по-видимому, помогает котрансляционному сворачиванию, — поэтому предельно оптимизированные гены иногда дают больше нерастворимого белка, а не больше активного. Перекодировка вдобавок меняет стабильность матрицы, способна создать или разрушить внутренние сайты посадки рибосомы и сигналы сплайсинга у эукариот и может внести сайты рестрикции или повторы, ломающие сборку.

Диапазон задают регуляторные элементы#

Уровень экспрессии — в основном свойство деталей вокруг кодирующей последовательности: силы промотора, сайта связывания рибосомы или контекста Козак, эффективности терминатора и копийности. В хорошо охарактеризованном шасси они ведут себя как приблизительно составляемые детали — для этого и существуют библиотеки измеренных промоторов, — но зависимость от контекста никуда не уходит: один и тот же промотор даёт разный выход в зависимости от соседней последовательности, остова плазмиды, фазы роста и штамма. Публикуемые силы деталей — условные измерения, а не константы.

Проектирование целого генома#

Сборка на масштабе хромосом, как в работе над синтетическим геномом дрожжей, снова меняет задачу: проектные решения — это делеции и перекодировки на протяжении мегабаз, а проверка — сохранит ли организм жизнеспособность. Эта работа показала и то, что геномы терпят обширную переделку — удаление интронов и генов транспортных РНК, поголовную замену кодонов, — и то, что небольшое число разумных по отдельности изменений может оказаться летальным в сочетании, и тогда дефект приходится отлаживать, возвращая его к конкретной правке.

Общий вывод: проектирование последовательностей — инженерная дисциплина с реальными ограничениями, и её предсказания слабеют тем сильнее, чем дальше конструкция от того охарактеризованного контекста, в котором измеряли её детали.