Терапевтические нуклеиновые кислоты

Олигонуклеотидный препарат находит мишень уотсон-криковским спариванием. Одно это свойство переворачивает обычную трудность разработки: сконструировать молекулу нужной специфичности становится задачей о последовательности, решаемой за столом, а «недоступный» белок, у которого нет кармана для связывания, делается доступным через подавление его матричной РНК. Поэтому всё трудное в этой области лежит ниже по течению от конструирования.

Три разных механизма

Малая интерферирующая РНК загружается дуплексом в белок Argonaute 2 в составе комплекса RISC; пассажирская цепь отбрасывается, а направляющая ведёт AGO2 к комплементарной мРНК, которую тот разрезает эндонуклеолитически. Механизм каталитический: один загруженный комплекс уничтожает множество транскриптов и сам сохраняется — отсюда подавление печёночной мишени на месяцы после одной подкожной инъекции.

Антисмысловые олигонуклеотиды в конфигурации гэпмера работают иначе: ДНК-подобное центральное окно образует с РНК гетеродуплекс и привлекает РНКазу H1, собственную нуклеазу клетки, разрезающую РНК-цепь. В отличие от RISC, РНКаза H1 активна в ядре, поэтому гэпмеры способны разрушать пре-мРНК и транскрипты, из ядра не выходящие.

Третий механизм вообще не деградационный. Полностью модифицированный стерический блокатор садится на сайт сплайсинга или энхансер сплайсинга и перенаправляет сплайсосому. Нусинерсен таким образом заставляет включить экзон 7 в транскрипт SMN2, превращая нефункциональный белок в функциональный; олигонуклеотиды пропуска экзона при мышечной дистрофии Дюшенна восстанавливают рамку считывания и дают укороченный, но частично работающий дистрофин.

Химия удерживает их в живых

Немодифицированная РНК разрушается сывороточными и тканевыми нуклеазами за минуты и фильтруется почкой. Поле держится на трёх модификациях. Фосфоротиоатный остов, где немостиковый кислород заменён серой, устойчив к нуклеазам и — что не менее важно — заставляет молекулу связываться с белками плазмы, что предотвращает немедленный почечный клиренс и открывает захват тканями. Модификации сахара по положению 2’ — метокси, фтор, метоксиэтил или запертый бициклический мостик — повышают сродство дуплекса и дополнительно закрывают доступ нуклеазам. Химическая модификация вдобавок гасит распознавание врождённым иммунитетом через эндосомальные Toll-подобные рецепторы, которое немодифицированные олигонуклеотиды запускают охотно.

Ограничение — доставка

Решающий инструмент отрасли — трёхвалентный лиганд на основе N-ацетилгалактозамина. Он связывает асиалогликопротеиновый рецептор, который экспрессирован на гепатоцитах в исключительно высокой плотности и возвращается на поверхность каждые несколько минут, давая повторные возможности захвата. Поэтому одобренные siRNA-препараты бьют по мишеням, экспрессируемым в печени, — транстиретину, PCSK9, ALAS1, компоненту комплемента C5 и другим: конъюгат решает задачу входа ровно для одного типа клеток.

Вход, однако, ещё не прибытие. Захваченный олигонуклеотид заперт в эндосоме, и доля, добирающаяся до цитозоля, где работают AGO2 или РНКаза H1, оценивается в единицы процентов и ниже. Почти весь введённый материал деградирует или выводится из клетки обратно. Дозу задаёт выход из эндосомы, а не аффинность. Расширение платформы за пределы печени — в мышцу, почку или через гематоэнцефалический барьер — требует либо равноценной пары рецептор—лиганд, либо местного введения; отсюда интратекальный путь для мишеней центральной нервной системы. Токсичность, связанная с остовом, — тромбоцитопения, активация комплемента, действие на почечные канальцы — следует за белковым связыванием фосфоротиоата и ограничивает, насколько дозу вообще можно поднимать.

Смежная статья: /technology/nucleic-acid-therapeutics/.