Генная терапия in vivo: AAV и лентивирусы

Генная терапия in vivo — это доставка нуклеиновой кислоты в ядро клетки пациента с помощью вируса, лишённого собственных генов. Всё, что определяет её возможности и границы, вытекает из биологии выбранного вируса, а не из терапевтической идеи.

AAV: эписома, которая держится, пока клетка не делится#

Аденоассоциированный вирус — небольшой безоболочечный парвовирус с одноцепочечным ДНК-геномом около 4,7 тысячи оснований. В рекомбинантном векторе от вируса остаются только инвертированные концевые повторы (ITR); всё между ними — трансген с промотором.

Попав в ядро, геном вектора не встраивается в хромосому сколько-нибудь заметно. Он теряет ITR-зависимую линейную форму, превращается в двухцепочечные кольцевые конкатемеры и существует как эписома. Следствие определяющее: экспрессия сохраняется годами в постмитотических тканях — сетчатке, ЦНС, скелетной мышце, — но разбавляется при каждом делении. Поэтому печень младенца, которая ещё растёт, теряет трансген, а печень взрослого удерживает его существенно дольше. Это, а не стабильность белка, объясняет вопрос о долговечности эффекта.

Тропизм задаётся капсидом: серотипы связывают разные поверхностные гликаны, а затем общий корецептор AAVR (KIAA0319L). Инженерия капсида — направленная эволюция, вставка пептидов, рациональный дизайн — это попытка сместить тропизм так, чтобы снизить дозу.

Три ограничения, которые не обходятся дозой#

Ёмкость. В вектор помещается около 4,7 тысячи оснований вместе с регуляторными элементами. Кодирующая последовательность дистрофина — свыше 11 тысяч; отсюда микродистрофины, укороченные конструкции, сохраняющие актин-связывающий домен и часть спектриновых повторов. Стратегия двойных векторов с рекомбинацией внутри клетки существует, но платит эффективностью.

Преформированный иммунитет. AAV — распространённый человеческий вирус, и значительная доля взрослого населения несёт нейтрализующие антитела к тому или иному серотипу. Такие пациенты в исследования не включаются. Введённая доза сама вызывает мощный гуморальный ответ, поэтому повторное введение того же серотипа практически невозможно — «одна доза» является не преимуществом дизайна, а ограничением.

Доза как токсикология. Системное введение при нервно-мышечных показаниях требует порядка 10^14 векторных геномов на килограмм — это огромная нагрузка капсидного белка и ДНК. Наблюдаемые последствия: активация комплемента, тромботическая микроангиопатия, острое поражение печени, а также CD8-ответ на капсид, уничтожающий трансдуцированные гепатоциты через несколько недель. Профилактическая иммуносупрессия смягчает, но не устраняет это.

Лентивирус: другая сделка#

Лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1 несёт РНК-геном, обратная транскрипция даёт ДНК, а интеграза встраивает её в хромосому. Ёмкость выше — около 8 тысяч оснований, — и трансген наследуется дочерними клетками, что необходимо для делящихся мишеней, прежде всего гемопоэтических стволовых клеток.

Плата — инсерционный мутагенез. Гамма-ретровирусные векторы первого поколения в испытаниях при X-сцепленном ТКИД активировали LMO2 энхансером своего LTR и вызывали лейкозы; после этого стандартом стали самоинактивирующиеся (SIN) конструкции с делетированным энхансером LTR и внутренним промотором. Лентивирусы к тому же предпочитают тела активно транскрибируемых генов, а не промоторные области. Риск снижен, но не обнулён, и клональное отслеживание интеграций остаётся частью долгосрочного наблюдения.