Биосинтетические стероиды

Стероидное ядро — циклопентанпергидрофенантрен — это четыре конденсированных кольца, почти сплошь состоящих из метиленовых и метиновых групп, химически неразличимых между собой. Синтетическая химия умеет работать там, где есть функциональная группа; здесь её нет. Именно поэтому промышленное производство кортикостероидов и половых гормонов держится на двух микробных стадиях, которые химия так и не вытеснила за семьдесят лет.

Первая стадия: отрезать боковую цепь, сохранив ядро#

Сырьё — фитостерины (ситостерин, кампестерин, стигмастерин), побочный продукт переработки соевого масла и таллового масла целлюлозного производства. От холестериноподобного скелета их отличает алкильная боковая цепь при C17, которую нужно удалить.

Актинобактерии рода Mycobacterium делают это штатно: для них стерин — источник углерода, и они деградируют боковую цепь последовательными циклами бета-окисления. Проблема в том, что дикий штамм не останавливается и разрушает само ядро. Промышленный штамм получают направленным выключением ферментов деградации кольца: инактивация 3-кетостероид-Δ1-дегидрогеназы (KstD) фиксирует продукт на андростендионе (AD), инактивация 3-кетостероид-9α-гидроксилазы (KshA) — на андростадиендионе (ADD), сохранение одной из активностей даёт 9-ОН-AD. Выбор продукта — это выбор того, какой ген выключен.

Вторая стадия: поставить кислород туда, где его не поставить иначе#

Противовоспалительная активность глюкокортикоидов требует кислорода при C11. Это неактивированный третичный C–H в глубине молекулы; селективно окислить его химически нельзя. Классический синтез кортизона Сарретта требовал более тридцати стадий.

Решение нашли в Upjohn в 1952 году: культура Rhizopus arrhizus гидроксилирует прогестерон в положение 11α за одну ферментацию. Работает цитохром P450 — гем-тиолатная монооксигеназа, которая активирует молекулярный кислород, расщепляет связь O–O и вставляет один атом кислорода в C–H, удерживая субстрат в жёсткой ориентации связывающим карманом. Региоселективность здесь геометрическая: её задаёт не реакционная способность связи, а то, какая связь оказалась направлена на активированный кислород. Для 11β-конфигурации, нужной гидрокортизону, используют Curvularia lunata. Тот же принцип обслуживает 1,2-дегидрирование при переходе к преднизолону.

Что ставит потолок#

Ограничение — не биология, а фазовое равновесие. Стерины практически нерастворимы в воде: концентрации в среде лежат на уровне микромолей, тогда как процесс должен работать при десятках граммов на литр. Реакция поэтому идёт на границе раздела фаз, и её скорость определяется массопереносом, а не kcat фермента. Отсюда весь арсенал приёмов — комплексование циклодекстринами, двухфазные системы с несмешивающимся растворителем, эмульсии, тонкое диспергирование субстрата, — и отсюда же длительность промышленных ферментаций, измеряемая сутками.

Второй предел — сопряжение у P450. Фермент требует восстановительных эквивалентов NAD(P)H, доставляемых редокс-партнёрами, и часть циклов расходуется вхолостую: вместо гидроксилирования выделяются супероксид или перекись водорода. Несопряжённый оборот тратит энергию клетки и повреждает её окислительным стрессом. Плюс сам продукт и промежуточные стероиды токсичны для продуцента, что ограничивает достижимый титр независимо от того, насколько хорош катализ.