Экзосомная терапия и внеклеточные везикулы

Клетка непрерывно сбрасывает мембрану. Собственно экзосомы возникают внутри клетки: впячивание эндосомальной мембраны образует внутрипросветные везикулы в мультивезикулярном тельце — в основном через машинерию ESCRT, — и они выходят наружу, когда это тельце сливается с плазматической мембраной. Микровезикулы, напротив, отпочковываются прямо от поверхности клетки. Апоптотические тельца происходят от гибнущих клеток. Все три перекрываются по размеру и по плавучей плотности, и, оказавшись в пробирке, ни одна везикула не хранит следа своего происхождения.

Это не педантизм, а центральная трудность направления. Международное общество по внеклеточным везикулам закрепило её в руководстве MISEV, рекомендовав нейтральный термин «внеклеточная везикула», если биогенез не показан прямо, — редкий случай, когда научное сообщество официально признаёт, что его препараты не соответствуют собственным названиям.

Почему ничто не разделяется чисто#

Каждый метод выделения сортирует по свойству, которое везикулы делят с чем-то ещё. Дифференциальное ультрацентрифугирование сортирует по седиментации и осаждает заодно белковые агрегаты. Эксклюзионная хроматография сортирует по гидродинамическому радиусу, а в плазме крови это то же окно, где находятся хиломикроны и липопротеины. Градиенты плотности помогают, но липопротеины высокой и низкой плотности лежат достаточно близко, чтобы перекрываться. Тангенциальная фильтрация отлично концентрирует и почти не различает. Осаждение полимером быстрее всех и наименее избирательно.

Средства характеризации наследуют ту же неоднозначность. Анализ траекторий наночастиц измеряет броуновское движение рассеивающих частиц и не отличает везикулу от липопротеина того же диаметра. Значит, «счёт частиц» — это счёт частиц, а дозирование в частицах на миллилитр есть дозирование неопределённой смеси.

Арифметика груза#

Предполагаемый механизм — перенос функционального груза (микроРНК, мРНК, белков) в клетку-мишень. Подсчёты РНК на везикулу раз за разом дают в среднем существенно меньше одной копии конкретной микроРНК на везикулу, так что при правдоподобных дозах большинство клеток-мишеней не получает ни одной копии молекулы, которой приписывают эффект. Поэтому часть наблюдаемой активности вероятнее объясняется сигналингом поверхностных белков и липидов, а не доставкой груза. Поглощение добавляет вторую скидку: интернализованные везикулы в основном идут эндолизосомальным путём, а выход из эндосомы здесь так же неэффективен, как у синтетических липидных наночастиц. Введённые системно везикулы к тому же за минуты уходят в макрофаги печени и селезёнки.

Активность, а не выход#

Масштаб производства — инженерная задача, решённая достаточно: перфузия в половолоконном биореакторе заметно повышает концентрацию везикул по сравнению с культурой во флаконах. Не решено другое: чем является продукт. Популяция везикул есть отражение состояния клетки-производителя и смещается с донором, номером пассажа, напряжением кислорода и составом среды; везикулы сыворотки загрязняют культуру, если сыворотку не обеднить, а обеднение никогда не бывает полным.

Лекарству нужны определённое действующее вещество, тест активности, привязанный к механизму, и спецификации, которые серия проходит или не проходит. Здесь действующее вещество — гетерогенная популяция, механизм оспаривается, а тесты активности остаются суррогатными. Именно это, а не отсутствие сигналов эффективности, объясняет, почему ни один экзосомный препарат не одобрен как таковой и почему FDA выпускало публичные предупреждения о безопасности неодобренных экзосомных продуктов, продаваемых клиниками.