Рекомбинантные коллаген и желатин

Коллаген — самый распространённый белок животного организма и структурно самый повторяющийся. Его промышленное производное, желатин, — это просто коллаген, денатурированный нагревом с кислотой или щёлочью. Оба сегодня получают почти исключительно из шкур и костей крупного рогатого скота и свиней, и оба необычно трудно производить рекомбинантно — по причине, лежащей в химии белка, а не в инженерии ферментации.

Спираль и остаток, который её удерживает

Последовательность коллагена — почти непрерывный повтор Gly-X-Y. Каждый третий остаток обязан быть глицином: три цепи свиваются в правозакрученную тройную спираль, в которой третья позиция смотрит в тесную сердцевину, и туда помещается только водородный боковой радикал глицина. В позиции X часто стоит пролин, в позиции Y — часто 4-гидроксипролин.

Этот гидроксипролин не декоративен. Гидроксилирование пролина по четвёртому положению в позиции Y существенно повышает температуру плавления спирали; без него последовательность человеческого коллагена денатурирует ниже температуры тела и бесполезна. Стабилизация носит стереоэлектронный характер — электроноакцепторный гидроксил задаёт нужную спирали конформацию кольца и геометрию остова, — с дополнительным вкладом упорядоченных водных мостиков.

Почему модификация и есть узкое место

Гидроксипролин не кодируется. Его вводит после трансляции пролил-4-гидроксилаза, диоксигеназа, зависимая от 2-оксоглутарата и требующая Fe(II), молекулярного кислорода и аскорбата как восстанавливающего кофактора. У бактерий и дрожжей её нет. Экспрессия одного лишь гена коллагена в Escherichia coli или Pichia поэтому даёт негидроксилированную цепь, не образующую устойчивой спирали при рабочих температурах, и стандартное решение — совместно экспрессировать функциональную пролил-4-гидроксилазу и подавать аскорбат, что превращает одногенную задачу в согласованную двухферментную систему, где нужно балансировать стехиометрию и снабжение кофакторами. Применялись также растительные и насекомые системы. Отдельный маршрут обходит вопрос целиком: бактериальные коллагеноподобные белки, например Scl2 из Streptococcus pyogenes, образуют устойчивые тройные спирали вовсе без гидроксипролина, стабилизируясь парами заряженных остатков, — полезно, но это не человеческий коллаген.

Чистота — это не функциональность

Два ограничения регулярно преуменьшают. Первое: молекула рекомбинантного коллагена — не ткань. Природная сборка фибрилл с характерной поперечной исчерченностью с периодом 67 нм зависит от телопептидов и от последующего ферментативного сшивания лизилоксидазой; очищенная растворимая спираль не воспроизводит её без дополнительной обработки.

Второе: функциональное свойство желатина — прочность геля, выражаемая числом Блума, и она возникает из частичной ренатурации тройноспиральных узловых зон при охлаждении. Это зависит от распределения длин цепей и от последовательности, поэтому определённый рекомбинантный желатин даёт отличную воспроизводимость между партиями, но не автоматически высокий Блум: две эти величины независимы.

Что рекомбинантный материал действительно даёт — определённый продукт животного происхождения без животного сырья, без риска прионных инфекций и без религиозных и диетических ограничений. Поэтому внедрение отчётливее всего идёт в медицинских изделиях, клеточных культурах и фармацевтических капсулах, а не в массовом пищевом желатине, где цену коллагена, извлечённого из шкур, перебить очень трудно.