Системы тестирования на стерильность

Компендиальный тест на стерильность по USP <71> и Ph. Eur. 2.6.1 пропускает пробу серии через мембрану с порами 0,45 микрометра, промывает мембрану, чтобы убрать остатки антимикробного продукта, переносит её в две питательные среды — одну инкубируют при 30–35 °C для бактерий, включая анаэробов, другую при 20–25 °C для грибов — и через четырнадцать суток смотрят, появилось ли видимое помутнение. Всё содержательное в методе состоит в том, что эта процедура способна и не способна установить.

Это выборочный тест, и арифметика здесь беспощадна

Стерильность — свойство каждой единицы в серии; тест исследует двадцать из них и в процессе их уничтожает. Если контаминирована некоторая доля единиц серии, вероятность поймать хотя бы одну прямо следует из биномиального распределения: при уровне контаминации одна единица на тысячу проверка двадцати даёт примерно двухпроцентный шанс положительного результата. Серия, контаминированная на таком уровне, пройдёт тест примерно в сорока девяти случаях из пятидесяти.

Поэтому нормативная рамка рассматривает испытание готового продукта как подтверждающую проверку, а не как источник гарантии стерильности. Гарантию даёт процесс: валидированный цикл финишной стерилизации с уровнем обеспечения стерильности один на миллион, а для продукта, который финишно стерилизовать нельзя, — валидация асептического процесса, розливы питательной среды, мониторинг среды производства и документированная стратегия контроля контаминации, которой требует Приложение 1 GMP ЕС. Тест на стерильность выявляет грубый отказ. Он не может удостоверить серию, которую процесс не сделал стерильной заранее.

Почему четырнадцать суток

Конечная точка — видимое помутнение, а для него культура должна дорасти до порядка ста миллионов клеток на миллилитр. Здоровый организм из богатой среды достигает этого быстро, но микроорганизмы, извлечённые из фармацевтического процесса, здоровыми не являются: они голодали, высыхали и получили сублетальные повреждения от дезинфектантов или нагрева. Повреждённая клетка сначала чинится и только потом делится, и вызванная ремонтом лаг-фаза может длиться сутками. Четырнадцатисуточная инкубация — это допуск на такую задержку и на действительно медленно растущие организмы, вроде видов Propionibacterium и части плесневых грибов.

Отсюда честно следуют два вывода. Среды универсальны лишь условно, и ни одна не поддерживает всё: организмы с необычными потребностями в питании или атмосфере, а также клетки в жизнеспособном, но некультивируемом состоянии, просто не будут учтены. Практически «стерильно» означает «не дало роста в этих двух средах при этих двух условиях за четырнадцать суток». Второй вывод: тест выполняет человек, работающий с открытыми ёмкостями, поэтому положительный результат с не меньшей вероятностью означает лабораторную контаминацию, чем контаминацию продукта, — и именно поэтому сам тест теперь ставят внутри барьерного изолятора, а каждый положительный результат запускает расследование, а не автоматическую отбраковку.

Чем быстрые методы заменяют рост

Альтернативные методы, охваченные Ph. Eur. 5.1.6, сокращают время, регистрируя то, что появляется раньше помутнения: аденозинтрифосфат по биолюминесценции, выделение углекислого газа или потребление кислорода в надмембранном пространстве, флуоресцентно меченные живые клетки методом твердофазной цитометрии, нуклеиновые кислоты через амплификацию. Каждый выигрывает время сменой наблюдаемой величины и наследует ограничения новой: респирометрические подходы всё равно требуют роста, только меньшего; амплификация нуклеиновых кислот сама по себе не отличает живой организм от остаточной ДНК погибшего. Поэтому валидация обязана показать равноценный предел обнаружения — в идеале до единичного организма — на представительном наборе видов.

Давление, заставляющее это решать, не экономическое. У аутологичного клеточного препарата срок годности может измеряться часами, и ждать четырнадцать суток результата, который придёт уже после введения пациенту, он не может.