Роботизированное биобанкирование и хранение проб

Автоматическое криохранилище обычно объясняют как способ быстрее найти пробирку. Настоящая причина его существования уже и физична: ниже точки замерзания биологический образец продолжает меняться, а скорость этих изменений определяется температурным порогом, не имеющим отношения к моменту появления льда.

Два способа убить клетку холодом

При охлаждении суспензии лёд зарождается сначала вне клетки. Кристаллизуется чистая вода, поэтому растворённые вещества концентрируются в убывающей незамёрзшей фракции, и клетка, оказавшись в гипертоническом растворе, осмотически теряет воду. При медленном охлаждении обезвоживание доходит до конца: клетка переживает лёд, но повреждается предельной концентрацией солей, сдвигом pH и уплотнением мембраны. При быстром охлаждении вода выйти не успевает, внутриклеточный раствор переохлаждается, и лёд зарождается внутри клетки — обычно это смертельно.

Повреждение поэтому растёт с обеих сторон, а оптимум лежит между ними: это двухфакторная гипотеза, сформулированная Питером Мазуром. Поскольку уход воды зависит от проницаемости мембраны и отношения поверхности клетки к её объёму, оптимум специфичен для типа клеток; привычный градиент в 1 °C в минуту — рабочее умолчание для многих клеток млекопитающих, а не закон. Проникающие криопротекторы, диметилсульфоксид или глицерин, смещают всю картину, снижая долю льда при любой температуре и повышая вязкость раствора, но сами токсичны при комнатной температуре — поэтому время контакта до замораживания и после оттаивания входит в протокол, а не остаётся мелочью.

Почему минус 80 — не архив

Ниже точки замерзания часть воды в криозащищённой пробе не кристаллизуется никогда: она превращается во всё более вязкий концентрированный раствор и в конце концов стеклуется. Для типичных водных растворов криопротекторов это стеклование лежит в области около −130 °C. Выше него остаточная фаза — жидкость, молекулярная подвижность отлична от нуля, и медленные процессы — перекристаллизация мелких кристаллов льда, агрегация белка, деградация нуклеиновых кислот — продолжаются со скоростью малой, но не нулевой. Ниже него времена релаксации становятся велики по сравнению со сроком жизни любого архива, и образец действительно остановлен.

Отсюда довод в пользу паровой фазы жидкого азота, где держат ниже примерно −150 °C, а не механических морозильников на −80 °C для долгосрочных фондов. Именно пар, а не погружение: жидкость, попавшая в негерметичную пробирку, уже становилась путём переноса инфекции между хранимыми образцами. Платой за эту безопасность служит вертикальный градиент температуры внутри сосуда, который приходится картировать и контролировать.

Отогрев значит не меньше охлаждения. Мелкие внутриклеточные кристаллы, безобидные при температуре хранения, растут при медленном отогреве, поэтому перекристаллизация делает скорость оттаивания самостоятельным фактором выживаемости.

Что на самом деле защищает автоматизация

Каждое ручное извлечение выносит штатив в воздух помещения, и пробирки, ехавшие вместе с нужной, кратковременно нагреваются — иногда выше температуры стеклования. Повреждение накапливается, остаётся невидимым и нигде не фиксируется. Автоматическое хранилище берёт одну пробирку внутри камеры, которая остаётся холодной и сухой; сухость тоже существенна, поскольку конденсат обмерзает поверх штрихкодов и срывает идентификацию. Выигрыш — ограниченная и запротоколированная термическая история каждого флакона.

Этот протокол не удобство. Никакой анализ не читает образец и не сообщает, насколько хорошо его хранили, поэтому по практикам ISBER и стандарту ISO 20387 пригодность образца выводится из записанной цепочки хранения и температуры. Метаданные и есть заявление о качестве.