Роботизированное биобанкирование и хранение проб

Автоматическое криохранилище обычно объясняют как способ быстрее найти пробирку. Настоящая причина его существования уже и физична: ниже точки замерзания биологический образец продолжает меняться, а скорость этих изменений определяется температурным порогом, не имеющим отношения к моменту появления льда.

Два способа убить клетку холодом#

При охлаждении суспензии лёд зарождается сначала вне клетки. Кристаллизуется чистая вода, поэтому растворённые вещества концентрируются в убывающей незамёрзшей фракции, и клетка, оказавшись в гипертоническом растворе, осмотически теряет воду. При медленном охлаждении обезвоживание доходит до конца: клетка переживает лёд, но повреждается предельной концентрацией солей, сдвигом pH и уплотнением мембраны. При быстром охлаждении вода выйти не успевает, внутриклеточный раствор переохлаждается, и лёд зарождается внутри клетки — обычно это смертельно.

Повреждение поэтому растёт с обеих сторон, а оптимум лежит между ними: это двухфакторная гипотеза, сформулированная Питером Мазуром. Поскольку уход воды зависит от проницаемости мембраны и отношения поверхности клетки к её объёму, оптимум специфичен для типа клеток; привычный градиент в 1 °C в минуту — рабочее умолчание для многих клеток млекопитающих, а не закон. Проникающие криопротекторы, диметилсульфоксид или глицерин, смещают всю картину, снижая долю льда при любой температуре и повышая вязкость раствора, но сами токсичны при комнатной температуре — поэтому время контакта до замораживания и после оттаивания входит в протокол, а не остаётся мелочью.

Почему минус 80 — не архив#

Ниже точки замерзания часть воды в криозащищённой пробе не кристаллизуется никогда: она превращается во всё более вязкий концентрированный раствор и в конце концов стеклуется. Для типичных водных растворов криопротекторов это стеклование лежит в области около −130 °C. Выше него остаточная фаза — жидкость, молекулярная подвижность отлична от нуля, и медленные процессы — перекристаллизация мелких кристаллов льда, агрегация белка, деградация нуклеиновых кислот — продолжаются со скоростью малой, но не нулевой. Ниже него времена релаксации становятся велики по сравнению со сроком жизни любого архива, и образец действительно остановлен.

Отсюда довод в пользу паровой фазы жидкого азота, где держат ниже примерно −150 °C, а не механических морозильников на −80 °C для долгосрочных фондов. Именно пар, а не погружение: жидкость, попавшая в негерметичную пробирку, уже становилась путём переноса инфекции между хранимыми образцами. Платой за эту безопасность служит вертикальный градиент температуры внутри сосуда, который приходится картировать и контролировать.

Отогрев значит не меньше охлаждения. Мелкие внутриклеточные кристаллы, безобидные при температуре хранения, растут при медленном отогреве, поэтому перекристаллизация делает скорость оттаивания самостоятельным фактором выживаемости.

Что на самом деле защищает автоматизация#

Каждое ручное извлечение выносит штатив в воздух помещения, и пробирки, ехавшие вместе с нужной, кратковременно нагреваются — иногда выше температуры стеклования. Повреждение накапливается, остаётся невидимым и нигде не фиксируется. Автоматическое хранилище берёт одну пробирку внутри камеры, которая остаётся холодной и сухой; сухость тоже существенна, поскольку конденсат обмерзает поверх штрихкодов и срывает идентификацию. Выигрыш — ограниченная и запротоколированная термическая история каждого флакона.

Этот протокол не удобство. Никакой анализ не читает образец и не сообщает, насколько хорошо его хранили, поэтому по практикам ISBER и стандарту ISO 20387 пригодность образца выводится из записанной цепочки хранения и температуры. Метаданные и есть заявление о качестве.