Масс-спектрометрия в характеризации биофармпрепаратов

Масс-спектрометр взвешивает ионы, поэтому первая трудность с белком в том, что он не ион и не находится в газовой фазе. Электрораспыление решает обе задачи. Поток жидкости проталкивается через иглу под напряжением в несколько киловольт; заряд накапливается на мениске, пока электростатическое напряжение не превысит поверхностное натяжение, вытягивая конус Тейлора, который испускает мелкие заряженные капли. Растворитель испаряется, плотность заряда растёт, капля достигает предела Рэлея и делится. Белок выходит наружу, неся сразу много протонов.

Многозарядность и делает метод возможным. Анализаторы разделяют по отношению массы к заряду, а не по массе, поэтому антитело массой 150 кДа с сорока зарядами оказывается около m/z 3750 — вполне внутри диапазона обычного прибора. Огибающую из множества зарядовых состояний затем сворачивают в одну массу.

Что должна купить разрешающая способность

Модификации, существенные для характеризации, малы. Окисление метионина добавляет около 15,995 Да. Дезамидирование аспарагина — 0,984 Да; на многозарядном ионе такую разницу приходится разрешать на фоне естественного изотопного распределения молекулы с тысячами атомов углерода. Этим и заняты анализаторы высокого разрешения. Орбитальная ловушка регистрирует наведённый ток ионов, колеблющихся в электростатическом поле, где частота колебаний зависит от m/z, и восстанавливает спектр преобразованием Фурье; разрешение растёт с длительностью записанного сигнала, что прямо разменивается на число спектров, снимаемых поперёк узкого хроматографического пика. Времяпролётные приборы измеряют время пролёта фиксированной базы, а рефлектрон компенсирует разброс начальных кинетических энергий, который иначе размыл бы момент прихода. Тройные квадруполи разрешением жертвуют намеренно: выделяя один предшественник и один фрагмент, они тратят весь рабочий цикл на единственный переход — поэтому следовой количественный анализ белка клетки-хозяина или вымываемой примеси остаётся задачей тройного квадруполя.

Подавление ионизации и требование к матрице

Слабое место измерения находится в источнике. Капля несёт конечный избыточный заряд, и аналиты конкурируют за него и за поверхность капли. Всё, что выходит одновременно с аналитом — соли, остатки детергента, продукты деградации полисорбата, полиэтиленгликоль, фосфолипиды, вспомогательные вещества, обильные пептиды самого белка, — забирает долю, меняет поверхностное натяжение и вязкость капли или скорость испарения. Сигнал аналита падает, иногда на порядок, без всякого изменения его концентрации и без признака на хроматограмме.

Подавление не является постоянной характеристикой прибора. Оно меняется по ходу градиента, от одной пробоподготовки к другой, между производственными сериями и между партиями готовой лекарственной формы. Калибровочная кривая, построенная в чистом растворителе, поэтому измеряет не ту чувствительность, с которой сталкивается проба, и даёт концентрацию, ошибочную в неизвестное число раз.

Две защиты следуют прямо из механизма. Готовить стандарты в матрице, подобранной под пробу, чтобы конкуренция была той же. Ещё лучше — добавить вариант аналита, меченный стабильным изотопом: химически он идентичен, выходит из колонки точно вместе с аналитом, испытывает то же подавление и отличается только массой, поэтому отношение аналита к стандарту переживает эффект источника, разрушающий каждый сигнал по отдельности. Без такого стандарта абсолютную концентрацию из электрораспыления следует читать как оценку: коэффициенты отклика у разных пептидов различны, и метод не является количественным сам по себе.