Приборы ВЭЖХ и UHPLC

Жидкостная хроматография разделяет потому, что каждый компонент распределяется между текущей подвижной фазой и неподвижной фазой, привитой к пористым частицам, и компоненты различаются силой этого распределения. Молекула, дольше связанная с неподвижной фазой, движется по колонке медленнее. Удержание — простая часть метода. Трудность в том, что каждая зона по дороге ещё и расплывается, и разрешение есть состязание между достигнутым разделением и накопленным размыванием.

Три способа размыть зону#

Размывание раскладывается на три вклада — классические члены уравнения Ван-Деемтера. Молекулы проходят по слою зернистого сорбента пути неодинаковой длины и приходят вразнобой. Они диффундируют вдоль колонки, и это тем существеннее, чем медленнее поток и больше времени на такую диффузию. И они обязаны продиффундировать внутрь застойной жидкости в поре частицы и обратно, чтобы вообще провзаимодействовать с неподвижной фазой, — а это тем существеннее, чем быстрее поток и раньше их сносит вниз, не дав установиться равновесию.

Поскольку второй член убывает со скоростью, а третий растёт, существует оптимальный расход. Важно другое следствие — что происходит при уменьшении диаметра частиц: путь диффузии внутрь зерна сокращается, член массопереноса резко падает, оптимум смещается к большим скоростям, а сама кривая уплощается. Мелкие частицы поэтому дают одновременно и более узкие пики, и более быстрый анализ.

Чем оплачена мелкая частица#

Сопротивление течению через зернистый слой растёт обратно пропорционально квадрату диаметра частиц. Переход от пяти микрометров к менее чем двум увеличивает требуемое давление примерно на порядок — и в этом вся причина существования систем сверхвысокого давления: UHPLC не иной принцип разделения, а гидравлическое следствие того же уравнения. Путь этот не бесконечен. Прокачка вязкой жидкости через сопротивление при очень высоком давлении рассеивает заметную мощность в виде тепла трения, создавая радиальный градиент температуры между сердцевиной колонки и стенкой, — а возникающий градиент вязкости снова размывает зоны, частично съедая выигрыш. Поверхностно-пористые частицы с твёрдым ядром бьют в тот же член массопереноса: тонкий пористый слой на сплошном ядре укорачивает путь диффузии без полной платы давлением.

Уменьшение колонки переносит и узкое место наружу. Объём инжектора, соединительных капилляров и ячейки детектора перестаёт теряться на фоне объёма колонки, поэтому достижимую эффективность на коротких колонках нередко задаёт внеколоночное размывание, а не качество набивки.

Чего детектор не видит#

Хроматограмма свидетельствует только о тех веществах, на которые отзывается детектор. Поглощение в ультрафиолете при 280 нм сообщает о триптофане, тирозине и цистине в дисульфидной связи; пептид, вспомогательное вещество, сахар или липид без ароматического остатка не дают сигнала вовсе и в профиле чистоты невидимы. Переход примерно к 214 нм позволяет детектировать саму пептидную связь и гораздо универсальнее, но там поглощают почти все растворители, буферы и добавки подвижной фазы, поэтому резко нарастают дрейф базовой линии и градиентные артефакты. Вещества без обоих хромофоров требуют детектирования по заряженному аэрозолю, по светорассеянию после испарения или масс-спектрометрического.

Выбор режима несёт собственные оговорки. Эксклюзионная хроматография должна быть чисто энтропийной, но остаточное взаимодействие белка с сорбентом вынуждает подавлять его добавлением соли — а эта соль несовместима с масс-спектрометром, который хотелось бы поставить следом. Разделение белков в обращённой фазе ведут в условиях, денатурирующих по самому своему замыслу.