Проточные цитометры в биопроизводстве

Проточный цитометр измеряет по одной клетке за раз и очень быстро — за счёт того, что не позволяет клеткам идти бок о бок. Поток пробы вводится внутрь более быстрой обжимающей жидкости; градиент скорости вытягивает сердцевину до нескольких микрометров в поперечнике и выстраивает клетки в цепочку через зону лазера. Каждая клетка даёт вспышку сигналов: свет, рассеянный вперёд под малыми углами, примерно следует размеру; рассеянный вбок — внутренней структуре и зернистости; флуоресценция связанного красителя или флуоресцентного белка излучается на длине волны больше возбуждающей.

Почему панели перестают расти

Соблазн — читать много маркеров сразу, и очевидное препятствие выглядит аппаратным: больше детекторов, больше лазеров. Это не так. Спектры испускания флуорохромов широки — десятки нанометров с длинным красным хвостом, — и полосовой фильтр, выбранный под один краситель, неизбежно собирает фотоны соседних. Такой перелив детерминирован и вычитаем: контроли с одиночным окрашиванием дают долю сигнала каждого красителя в каждом детекторе, а компенсация обращает эту матрицу.

Чего компенсация отменить не может — это шум. Регистрация фотонов есть процесс счёта, поэтому вклад перелива с некоторым средним несёт с собой и дисперсию, а вычитание среднего оставляет дисперсию на месте. Возникает ошибка расширения: тусклая популяция в одном канале становится шире — не сдвинутой, а размазанной — пропорционально яркости постороннего маркера на той же клетке. Добавьте в панель яркий краситель, и слабый маркер в другом канале может перестать разрешаться, причём в анализе нигде не возникнет ошибки. Именно это расширение, формализуемое матрицей расширения перелива, и ограничивает размер панели; поэтому распределение красителей — задача проектирования: самые яркие флуорохромы отдают самым слабым антигенам, а красители с близким испусканием разводят по маркерам, которые не экспрессируются совместно.

Полноспектральная цитометрия заменяет фильтры детекторной линейкой, читающей весь профиль испускания, и разделяет его по эталонным спектрам. Потолок это поднимает заметно, поскольку используется информация о форме спектра, которую трёхфильтровая схема выбрасывает, — но исходное ограничение выживает: два красителя с почти совпадающими спектрами почти коллинеарны как векторы, задача разделения становится плохо обусловленной, и шум усиливается. Собственная флуоресценция клеток, в основном от NAD(P)H и флавинов, — ещё одна спектральная компонента, и обращение с ней как с компонентой разделения, а не как с фоном для вычитания, — один из настоящих выигрышей спектрального подхода.

Сортировка и статистика редкого

Сортировщик добавляет сопло, колеблющееся на высокой частоте, так что струя распадается на одинаковые капли на фиксированном расстоянии. Прибор принимает решение о клетке в зоне опроса, затем заряжает струю в момент отрыва её капли, и отклоняющие пластины уводят каплю в нужный сосуд. Производительность ограничивают две вещи. Во-первых, клетки приходят случайно, и их распределение по каплям пуассоновское: на высокой частоте событий целевая капля всё чаще содержит и постороннюю клетку, а прибор должен либо отменить событие, либо принять примесь. Чистота и выход размениваются напрямую, и курс обмена задан этой статистикой.

Во-вторых, работа с редкими событиями ограничена счётом. Чтобы увидеть популяцию с долей одна на миллион, нужно набрать десятки миллионов событий, иначе доверительный интервал бесполезен, — и анализы на остаточные клетки и выпускающий контроль становятся вопросом времени набора и объёма пробы раньше, чем вопросом о приборе.