Счётчики клеток и системы определения жизнеспособности

Счётчик клеток выдаёт два числа — концентрацию и жизнеспособность, — и только одно из них является прямым измерением. Концентрация — задача счёта. Жизнеспособность — вывод по косвенному признаку, и выбор признака определяет, что именно означает полученное число.

Трипановый синий отвечает на более узкий вопрос, чем кажется

Трипановый синий — крупный анионный азокраситель. Целая плазматическая мембрана его не пропускает; попав внутрь, он связывается с цитозольным белком, и клетка окрашивается. Значит, это проба на целостность мембраны и ни на что больше. Клетка в ранней стадии апоптоза сохраняет целую мембрану, когда каскад каспаз уже необратим, и учитывается как живая. В культуре, начавшей умирать, трипановый синий систематически завышает жизнеспособность — и делает это сильнее всего именно там, где верный ответ важнее всего. Краситель к тому же цитотоксичен, а окно окрашивания короткое: передержанная смесь даёт падение жизнеспособности, вызванное самим измерением. Он окрашивает и свободный белок, поэтому богатая обломками культуральная жидкость поздней стадии даёт ложные синие объекты.

Приборы на анализе изображений автоматизируют ту же химию через светлопольную оптику и сегментацию. Настоящая трудность у них не в детекции, а в разделении агрегатов: дублет, посчитанный как один объект, и скопление, посчитанное как один крупный объект, одинаково занижают концентрацию, а алгоритмы их разделения субъективны и у каждого производителя свои. Два прибора, расходящиеся на одной и той же суспензии, обычно расходятся в сегментации, а не в окрашивании.

Импеданс и флуоресценция отвечают на разные вопросы

Принцип Коултера измеряет нечто совсем иное. Клетка, протянутая через узкую апертуру между двумя электродами, вытесняет проводящий электролит, и амплитуда возникающего импульса сопротивления пропорциональна объёму клетки. Это даёт отличные распределения по размеру и точный счёт — и совершенно безразлично к тому, жива ли клетка. Собственный предел метода — совпадения: при высокой концентрации две клетки проходят апертуру вместе и регистрируются как одна более крупная, поэтому пробу разбавляют до диапазона, который прибор разрешает.

Флуоресцентный счёт разделяет эти два вопроса чисто. Проникающий ядерный краситель, например акридиновый оранжевый, метит каждую ядросодержащую клетку; иодид пропидия, не проходящий сквозь целую мембрану, метит лишь те, что её потеряли. Счёт ядер, а не объектов, убирает из результата обломки и безъядерные частицы — поэтому флуоресцентные методы устойчивее светлопольных на материале стадии сбора. Плата за это — безъядерные клетки методу не видны. Чтобы увидеть популяцию, которую трипановый синий считает неверно, нужен другой маркер: аннексин V связывает фосфатидилсерин, вынесенный на внешний слой мембраны в раннем апоптозе, до изменения проницаемости, и читается проточной цитометрией.

Метаболические пробы — восстановление тетразолия, резазурин — иногда принимают за счёт клеток. Они измеряют активность редуктаз. Сигнал пропорционален числу клеток лишь при постоянной удельной активности, а она непостоянна: меняется с фазой роста, плотностью и стрессом. Эти пробы сообщают о метаболической мощности, и читать их как жизнеспособность — подмена понятий.

Статистический предел

Счёт — пуассоновский процесс, поэтому относительное стандартное отклонение счёта из N событий равно 1/√N. Сотня посчитанных клеток несёт около 10 % неопределённости; поле камеры Горяева примерно в этом диапазоне. Отличить 99 % жизнеспособности от 97 % можно, лишь просмотрев тысячи клеток, потому что оценивается малая мёртвая доля. Автоматические приборы оправданы главным образом тем, что делают N достаточно большим для устойчивого ответа, а не тем, что окрашивают лучше человека.