Капиллярный электрофорез в биофармацевтике

Ион в электрическом поле разгоняется, пока электрическая сила не уравновесится гидродинамическим сопротивлением, после чего движется с постоянной скоростью, задаваемой отношением заряда к коэффициенту трения. Это отношение и есть электрофоретическая подвижность — и само по себе оно разделяет меньше, чем подсказывает интуиция. У линейного полиэлектролита вроде ДНК добавление звена добавляет заряд и сопротивление почти в равной пропорции, поэтому подвижность перестаёт зависеть от длины. В свободном растворе фрагменты в сто и в тысячу оснований идут вместе. Почти всё содержание метода — это способы обойти данное обстоятельство.

Зачем капилляр

Разрешение растёт с приложенным напряжением, но ток через проводящий буфер выделяется как джоулево тепло, а горячая сердцевина при холодной стенке создаёт радиальный градиент вязкости, размывающий любую зону. Кварцевый капилляр внутренним диаметром 25–75 микрометров имеет крайне высокое отношение поверхности к объёму, поэтому теплу, выделенному в просвете, почти не нужно никуда идти, чтобы достичь термостатируемой стенки. Именно это допускает напряжённость поля в сотни вольт на сантиметр и является единственной причиной, по которой геометрия здесь капиллярная, а не пластинчатая.

Та же кварцевая стенка порождает вторую характерную особенность. Примерно выше pH 3 поверхностные силанольные группы депротонируются, у стенки формируется катионный двойной слой, и поле увлекает его, а вместе с ним и весь объём жидкости, — это электроосмотический поток. Он полезен, когда проносит мимо детектора нейтральные и анионные частицы, но дрейфует с буфером, температурой и историей стенки, поэтому количественные методики обычно не управляют им, а подавляют ковалентным или динамическим покрытием.

Два рабочих режима

CE-SDS решает задачу «заряд против сопротивления» так же, как пластинчатый электрофорез: детергент связывается с белком примерно в постоянном массовом отношении и подавляет собственный заряд молекулы, поэтому подвижность зависит только от того, как цепь тормозится сменной ситовой полимерной матрицей. Гелевая пластина заменяется прибором, прямо интегрирующим площади пиков, — и это то, что делает метод пригодным для выпускающего контроля чистоты в рамках USP <1053>. Слабое место — оптика: длина оптического пути равна просвету капилляра, поэтому чувствительность в ультрафиолете низка, и малые примеси часто требуют лазер-индуцированной флуоресценции после мечения. Пробоподготовка тоже не нейтральна: нагрев антитела в присутствии детергента способен расщепить уязвимые участки шарнирной области, и пик фрагмента может быть порождён самим анализом, который должен его выявлять.

Изоэлектрическое фокусирование в капилляре с визуализацией использует амфотерные носители-амфолиты, которые под действием поля выстраиваются в устойчивый градиент pH. Белок мигрирует до значения pH, где его суммарный заряд равен нулю, и останавливается; диффузия из этой точки возвращает ему заряд, который толкает его обратно, поэтому зона самозаостряется. Съёмка всей колонки по поглощению в ультрафиолете снимает стадию мобилизации, которая прежде давала основную количественную ошибку.

Ограничения здесь химические. Измеряется кажущаяся изоэлектрическая точка, зависящая от состава амфолитов, температуры и добавленной мочевины; переносить это значение между методиками как абсолютное нельзя. Хуже того, растворимость белка минимальна именно в изоэлектрической точке, поэтому фокусирование подводит аналит к порогу выпадения в осадок: для гидрофобных и склонных к агрегации молекул именно это, а не разрешение, решает, применим ли метод.