Биосинтетические каннабиноиды

Каннабиноиды — гибридные молекулы: половина каждой происходит из метаболизма жирных кислот, половина из терпенового. Это строение объясняет всё семейство и привлекательность микробного маршрута.

Построение предшественника

Ароматическая половина начинается с гексаноил-КоА, шестиуглеродной ацильной группы. Поликетидсинтаза удлиняет её тремя звеньями малонил-КоА, а циклаза сворачивает полученную цепь в ароматическое кольцо, давая оливетоловую кислоту — резорцин с пятиуглеродной боковой цепью.

Терпеновая половина — это геранилпирофосфат, стандартный десятиуглеродный изопреноидный строительный блок. Ароматическая пренилтрансфераза соединяет две половины, давая каннабигероловую кислоту (CBGA).

CBGA и есть точка ветвления. От неё происходит каждый крупный каннабиноид.

Ветвление и что задаёт соотношение

За CBGA конкурируют два фермента, и оба являются FAD-зависимыми оксидоциклазами, замыкающими терпеновую цепь в кольцо с выделением пероксида водорода.

THCA-синтаза замыкает его одним способом, давая тетрагидроканнабиноловую кислоту. CBDA-синтаза замыкает иначе, давая каннабидиоловую кислоту. Они работают с одним и тем же субстратом, поэтому соотношение продуктов задаётся относительной активностью двух ферментов, что у растения определяется тем, какие рабочие аллели оно несёт. Поэтому хемотип растения наследуем и примерно бинарен, и поэтому в микробной системе соотношение является проектным решением: экспрессируйте один фермент — и получите один продукт, без задачи разделения.

Третий вариант оставляет CBGA непревращённой, и так получают каннабигерол.

Почему растение делает кислоты, а продуктом является не кислота

Ферменты дают карбоновые кислоты — THCA, CBDA, CBGA, — а не нейтральные соединения. THCA не является психоактивной. Нагрев отщепляет карбоксильную группу в виде CO₂, превращая THCA в THC, а CBDA в CBD.

Декарбоксилирование, таким образом, является намеренной технологической стадией, и поэтому же сырое растительное сырьё ведёт себя иначе, чем нагретый препарат. В ферментационном маршруте та же стадия сохраняется и является термической химией, а не биологией.

Смена стартового звена меняет всё

Пятиуглеродная боковая цепь распространённых каннабиноидов происходит от гексаноил-КоА. Подайте поликетидсинтазе бутирил-КоА — и она построит диварионовую кислоту с трёхуглеродной боковой цепью, ведущую к пропильному ряду: CBGV, THCV, CBDV.

Это чистая демонстрация того, как работают такие пути. Остальные ферменты не меняются; иное стартовое звено проходит через всю последовательность и даёт параллельное семейство. У растения длина боковой цепи зависит от доступности предшественника и плохо управляема. В инженерном организме её задают кормлением или устройством пути, — и поэтому редкие каннабиноиды, присутствующие в растении на уровне долей процента, являются самым сильным коммерческим доводом в пользу ферментационного маршрута.

Где трудно

Узким местом является пренилтрансфераза. Она связана с мембраной и плохо экспрессируется в дрожжах, а её субстрат GPP является промежуточным продуктом, который хозяин хочет и для синтеза стеринов, так что он оттягивается. Инженерия поэтому сосредоточена на снабжении GPP и на экспрессии мембранного белка, а не на поликетидной половине.

Регуляторный статус зависит от юрисдикции и определяется молекулой и её концентрацией, а не происхождением.