Сексирование спермы и репродуктивные биотехнологии

Пол у млекопитающих определяет сперматозоид, и две популяции сперматозоидов различаются ровно одним свойством, измеримым массово: X-хромосома крупнее Y, поэтому клетка, несущая X, содержит чуть больше суммарной ДНК. У крупного рогатого скота разница составляет около 3,8%. Ничто другое — подвижность, морфология, поведение поверхности — не различается достаточно надёжно для разделения в потоке, поэтому вся коммерческая технология держится на том, чтобы разрешить разницу в несколько процентов содержания ДНК у клетки, которая ни сферична, ни оптически проста.

Как измеряют 3,8%

Метод — проточная цитометрия. Сперматозоиды окрашивают связывающимся с ДНК флуорохромом, чаще всего Hoechst 33342: он выбран потому, что входит в живую клетку, не убивая её, — отсортированная клетка должна потом оплодотворять, а это исключает фиксацию, допустимую в обычной цитометрии. Окрашенные клетки проходят поодиночке через луч лазера, и интенсивность флуоресценции, пропорциональная количеству ДНК, даёт два перекрывающихся пика.

Две вещи усложняют картину. Головка сперматозоида уплощена и похожа на лопатку, поэтому измеренная флуоресценция сильно зависит от её ориентации относительно детектора; без ориентирования разброс от поворота клетки полностью перекрывает сигнал в 3,8%. Поэтому сортеры используют геометрию сопла и скошенную ориентирующую оптику, заставляя головки поворачиваться одной стороной, и регистрируют сигнал под заданным углом. Кроме того, распределения перекрываются: прибор обязан отнести каждое событие к одной из групп, а события, которые нельзя отнести уверенно, отбрасываются, а не угадываются. Чистота порядка 90% и выше достижима штатно — за счёт щедрого отбрасывания.

Скорость — это цена, повреждение — это оплодотворяемость

Раз клетки обрабатываются поодиночке, производительность задана числом событий, которое прибор успевает классифицировать: тысячи клеток в секунду против миллиардов в эякуляте. Именно эта арифметика, а не стоимость реагентов, объясняет цену сексированного семени и то, почему в дозе клеток на порядок меньше, чем в обычной.

Клеткам при этом достаётся. Сексированное семя стабильно даёт несколько более низкую оплодотворяемость, чем обычное, и причины складываются, а не сводятся к одной: разбавление и долгая обработка, связывание красителя с ДНК, экспозиция лазером, механические и электростатические нагрузки капельной сортировки, меньшее число клеток в дозе. Улучшения последнего десятилетия шли по каждому из этих пунктов — меньшее давление, меньшая мощность лазера, более быстрая обработка, — и разрыв сузился, но не исчез. Поэтому сексированное семя применяют выборочно, на тёлках и коровах с хорошим ожидаемым результатом, а не по всему стаду.

Обойти цитометр

Более новые подходы стараются убрать либо стоимость стадии сортировки, либо её вред. Одно направление сохраняет измерение флуоресценции, но заменяет механическое отклонение капель лазерной абляцией ненужной популяции: отбракованные клетки убивают на месте, а не отводят физически. Другое отказывается от измерения ДНК вовсе и ищет функциональное различие — сообщавшиеся различия в экспрессии рецепторов между двумя популяциями, которые позволили бы обездвижить или отобрать одну из них химически. Эти работы научно оспариваются, и отрасль чётко разделяет сообщение о различии в маркёре и продемонстрированное воспроизводимое соотношение полов у потомства.