Прецизионная ферментация

Обычная ферментация собирает то, что организм делает и так. Прецизионная ферментация встраивает ген, которого у организма не было, чтобы он производил заданную молекулу — белок, фермент, олигосахарид, ароматическое соединение, — которую затем отделяют от самого организма. Микроб здесь шасси; смысл — в продукте.

Выбор хозяина — набор компромиссов, а не рейтинг

Escherichia coli растёт быстро и легко поддаётся инженерии, но большинство белков не секретирует, а сверхэкспрессированный белок часто выпадает внутри клетки в тельца включения, которые приходится растворять и заново сворачивать — с потерей материала. Дрожжи вроде Komagataella (Pichia) эффективно секретируют и набирают очень высокую плотность культуры на метаноле или глицерине. Нитчатые грибы, включая Trichoderma и Aspergillus, — чемпионы секреции, эволюционно приспособленные выбрасывать ферменты наружу.

Решающим обычно оказывается вопрос посттрансляционной модификации. Многие животные белки гликозилированы, а рисунок гликозилирования у дрожжей и грибов отличается от млекопитающего — чаще высокоманнозный, а не сложный. Для пищевого ингредиента это может не иметь значения; там, где структура сахара влияет на функцию или иммуногенность, значение огромно, и именно поэтому существуют гликоинженерные штаммы-хозяева.

Титр, скорость и выход тянут в разные стороны

Работу процесса описывают три числа: титр (продукт на литр), скорость (продукт на литр в час) и выход (продукт на единицу субстрата). Они не независимы. Заставляя клетку отдавать продукту больше углерода, вы отбираете углерод у роста, поэтому высоковыходной штамм часто растёт медленно; ускорение даёт больше тепла и требует больше кислорода.

Обычный жёсткий потолок — кислород. Он плохо растворим в воде, поэтому аэробная ферментация ограничена скоростью его переноса из пузырьков в жидкость. Скорость переноса зависит от перемешивания и аэрации, а обе стоят энергии и создают сдвиг; выделяющееся тепло приходится снимать через поверхность, которая растёт медленнее обслуживаемого объёма. Поэтому процесс, работающий в 10 литрах, не масштабируется простым увеличением.

Выделение обычно и есть дорогая половина

Для секретируемого продукта выходящая из ферментёра культуральная жидкость — разбавленный раствор целевой молекулы в сложной смеси клеток, компонентов среды и собственных белков хозяина. Отделение включает удаление клеток, концентрирование, одну или несколько хроматографических или осадительных стадий и получение готовой формы, и у каждой выход меньше единицы, а они перемножаются. Для несекретируемого продукта добавляется лизис клеток, выпускающий в ту же смесь всё их содержимое.

Поэтому стадия выделения часто доминирует и в себестоимости, и в капитальных затратах, а рост титра окупается дважды: больше продукта и меньше объёма на его единицу.

Что действительно ограничено

Существует термодинамический потолок того, сколько продукта даст заданный источник углерода и энергии; его задают стехиометрия пути и собственные затраты клетки на поддержание. Публикуемые экономические прогнозы отрасли расходятся широко, потому что по-разному предполагают, насколько близко процесс подходит к этому потолку, какова цена сырья и требуется ли очистка пищевого или фармацевтического класса. Разногласие живёт именно в этих допущениях, а не в биологии.